Journal Club: The protein kinase Akt acts as a coat adaptor in endocytic recycling
Recikliranje putem endocitoze potrebno je za veliki broj staničnih događaja kao što su stanično gibanje i polarnost, unos hranjivih tvari te prijenos signala.
Najčešće je riječ o endocitozi određenog staničnog receptora za koji je vezan ligand koji se unosi u stanicu, otpušta s receptora i dalje vrši svoju funkciju, dok se receptor za koji je taj ligand bio vezan reciklirajućim endosomima vraća na staničnu membranu. Ovakva vrsta endocitoze odvija se klatrinom obloženim vezikulama. Vrste recikliranja putem endocitoze jesu konstitutivno recikliranje, za čije istraživanje se koristi transferinski receptor kao model, i recikliranje ovisno o stimulaciji, za čije istraživanje se koristi α5β1 integrin kao model. Za odvijanje recikliranja potrebni su adaptorski proteini kao što je ANK (ankyrin-repeat) repeat and PH domain-containing protein 1 (ACAP1) koji djeluje kao adaptor klatrinskog omotača za obje vrste recikliranja te transportira teret od reciklirajućih endosoma do stanične membrane. U recikliranju ovisnom o stimulaciji, ACAP1 se veže za β1 podjedinicu α5β1 integrina te se mora fosforilirati, što čini Akt kinaza. Iako se obično kinaze prolazno vežu za svoje supstrate, uočeno je da se Akt vrlo stabilno veže za ACAP1 prilikom recikliranja α5β1 integrina. Stoga su autori odlučili istražiti mogućnost da Akt, osim fosforilacije, ima i funkciju oblaganja vezikula.
Pull-down eksperimentima i provedbom Western blot analize uočeno je da se ACAP1 ne veže na α5 podjedinicu α5β1 već se na nju veže Akt, bilo sam, bilo vezan na ACAP1. Akt ima dvije velike domene: pleckstrin homology (PH) domenu i kinaznu domenu. Autori su uočili da se samo kinazna domena veže za α5 podjedinicu α5β1 integrina, dok se ta ista kinazna domena veže za GTPase-activating protein (GAP) domenu i ANK domenu ACAP1 proteina, navodeći tako na zaključak da Akt djeluje kao ko-adaptor s ACAP1 u vezanju tereta. Kako bi potvrdili ne-kinaznu ulogu Akt, autori su mutirali ACAP1 na način da je stalno u fosforiliranom, odnosno aktivnom stanju što recikliranje integrina čini konstitutivnim procesom za koji više nije potrebna fosforilacija preko Akt. Kad se u stanicama koje eksprimiraju mutirani ACAP1 uvede siRNA za AKT1 i AKT2 inhibira se recikliranje integrina koje se može spasiti uvođenjem divljeg tipa, ali i katalitički neaktivnog oblika Akt. Ovi rezultati su potvrđeni i korištenjem inhibitora za Akt koji nema utjecaj na recikliranje integrina i pokazuju da Akt ima i ne-kinaznu ulogu u recikliranju integrina.
Nakon istražene uloge Akt u recikliranju α5β1 integrina, autori su istražili ulogu ove kinaze u konstitutivnom recikliranju, odnosno recikliranju transferinskog receptora. Tretiranje stanica sa siRNA za AKT1 i AKT2 dovodi do inhibicije recikliranja transferina, što se opet može spasiti dodavanjem divljeg tipa, kao i katalitički neaktivnog tipa Akt. Kao i kod recikliranja integrina, ovi rezultati su potvrđeni korištenjem Akt inhibitora, a također je uočeno da se Akt direktno veže za sortirajuće signale transferinskog receptora. Ova vezna mjesta su jednaka veznim mjestima ACAP1 za transferinski receptor, no stvaranjem konstrukata homodimera veznih mjesta ACAP1 i Akt te heterodimera veznih mjesta ACAP1/Akt i pull-down esejima uočeno je da se za transferinski receptor najbolje veže heterodimer ACAP1/Akt što potvrđuje da ACAP1 i Akt djeluju zajedno u vezanju transferinskog receptora.
Osim što vežu teret, adaptorski proteini povezuju klatrin s teretom vezikula. Stoga su autori odlučili istražiti ima li Akt i takvu ulogu. Uočeno je da se Akt direktno veže za klatrin, te da se α5 i transferinski receptor jedino uz Akt mogu vezati za klatrin. Također, Akt je potreban za vezanje ACAP1 za klatrin, no i ACAP1 je potreban za vezanje Akt za klatrin što njih dvoje čini ko-adaptorima.
Ovi rezultati pokazuju da Akt kinaza ima i ne-kinaznu ulogu te da djeluje kao adaptor klatrinske obloge u recikliranju putem endocitoze. S obzirom da je uočeno da mnoge kinaze djeluju u različitim stadijima endocitoznog puta kao regulatori, moguće je da neke od njih imaju i druge, efektorske uloge. Ovo istraživanje, objavljeno u Nature Cell Biology, daje potpuno novi i jedinstveni pogled na ulogu kinaza u endocitoznom putu, a dostupno je i u open access obliku.
